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细胞表面抗原(Cell Surface )流式检测

Staining Cell Surface Targets For Flow Cytometry

细胞表面抗原免疫荧光染色(流式分析)

 

细胞表面抗原免疫荧光染色-流式分析步骤:

此步骤做交流学习用,具体的实验方案因实验而异。

A.组织和细胞收集

  1. 收集理想组织(如脾脏、淋巴结、胸腺、骨髓)并制备悬浮于细胞染色缓冲液(cell staining buffer)的单细胞悬液。如果使用体外刺激细胞,只需将刺激活化的细胞简单悬浮于细胞染色缓冲液(cell staining buffer)。
  2. 加细胞染色缓冲液(cell staining buffer)高达~15ml,然后350xg离心5min,吸掉上清。

B.红细胞裂解

  1. 3ml 红细胞裂解液(1× RBC Lysis Buffer)重悬细胞或根据具体情况加入相应量的红细胞裂解液。冰上孵育5min
  2. 10ml细胞染色缓冲液(cell staining buffer)到管内终止细胞裂解,然后350xg离心5min,吸掉上清。
  3. 如步骤2重复一次清洗。
  4. 细胞计数,用细胞染色缓冲液冲重悬细胞使浓度为5-10 x 106 cells/ml,按照100µl/管分装细胞悬液到12 x 75mm塑料管中(5-10 x 105 cells/ml)。

CFc受体封闭

  1. 阻断Fc受体的试剂适用于降低非特异性免疫荧光染色。小鼠样本,使用特异性结合FcγR III/IITruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32) 抗体可用于封闭抗体的非特异性染色。此种情况下,100 µl染色体积按照每106个细胞加入1µg TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32) 抗体,混匀,冰上孵育5-10min
  2. 人样本,每100 µl染色体积加入5µl Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking SolutionFc受体封闭剂),混匀,室温孵育5-10min。在不含有有效/可得的封闭抗体情况下,使用过量的相同物种来源的纯化IgG和免疫荧光染色用抗体相同来源的IgG亚型作为替代方法来封闭细胞。

D.抗体的细胞表面染色

  1. 按照预先优化的浓度,加入合适的荧光素、生物素偶联抗体或纯化的一抗(如: anti-CD3-FITC, anti-CD4-Biotin, and anti-CD8-APC,冰上避光孵育15-20min
  2. 至少使用2ml细胞染色缓冲液(cell staining buffer)清洗细胞,350xg离心5min,吸掉上清。重复一次。
  3. 如果使用纯化的一抗,需在残留的缓冲液中重悬细胞,加入预先优化浓度的荧光二抗,冰上避光孵育15-20min
  4. 重复步骤10
  5. 0.5ml细胞染色缓冲液(cell staining buffer)重悬细胞,每106个细胞加入5µl0.25µg7-AAD染色液( 7-AAD Viability Staining Solution)对死细胞染色。
  6. 避光冰上孵育3-5min
  7. 用流式细胞仪分析结果。【注意】:如果不能立即使用流式细胞仪分析样品,避光保存样品,并且置于4-8保存。样品必须重悬于细胞染色液中。注意细胞样品不应该放在固定缓冲液更长时间,因其会影响荧光素构象和荧光信号。

实验材料:

品牌

货号

名称

规格

价格(元)

MKbio

MX1501-100ML

Red Blood Cell Lysis Buffer 红细胞裂解液

100ml

120

MKbio

MX1504-500ML

Cell Staining Buffer 细胞染色缓冲液

500ml

250

MKbio

MX1505-50T

Fc Receptor Blocking Solution, Human Fc受体阻断剂(同Human TruStain FcX™

50T

1060

Biolegend

422301

Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution)

50T

1190

Biolgend

422302

Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution)

200T

2730

MKbio

MX4216-150T

7-AAD Viability Staining Solution 7-AAD细胞活力染色液

150T

150

BD Falcon

352063

5ml圆底试管(流式管)12X75MM聚丙烯锁扣帽

25/

56

BD Falcon

352063

5ml圆底试管(流式管)12X75MM聚丙烯锁扣帽

500/

732

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