Staining Cell Surface Targets For Flow Cytometry

细胞表面抗原免疫荧光染色（流式分析）

细胞表面抗原免疫荧光染色-流式分析步骤：

此步骤做交流学习用，具体的实验方案因实验而异。

A．组织和细胞收集

1. 收集理想组织（如脾脏、淋巴结、胸腺、骨髓）并制备悬浮于细胞染色缓冲液（cell staining buffer）的单细胞悬液。如果使用体外刺激细胞，只需将刺激活化的细胞简单悬浮于细胞染色缓冲液（cell staining buffer）。
2. 加细胞染色缓冲液（cell staining buffer）高达~15ml，然后350xg离心5min，吸掉上清。

B．红细胞裂解

1. 用3ml 红细胞裂解液（1× RBC Lysis Buffer）重悬细胞或根据具体情况加入相应量的红细胞裂解液。冰上孵育5min。
2. 加10ml细胞染色缓冲液（cell staining buffer）到管内终止细胞裂解，然后350xg离心5min，吸掉上清。
3. 如步骤2重复一次清洗。
4. 细胞计数，用细胞染色缓冲液冲重悬细胞使浓度为5-10 x 10⁶ cells/ml，按照100µl/管分装细胞悬液到12 x 75mm塑料管中（5-10 x 10⁵ cells/ml）。

C．Fc受体封闭

1. 阻断Fc受体的试剂适用于降低非特异性免疫荧光染色。小鼠样本，使用特异性结合FcγR III/II的TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32) 抗体可用于封闭抗体的非特异性染色。此种情况下，100 µl染色体积按照每10⁶个细胞加入1µg TruStain FcX™ (anti-mouse CD16/32) 抗体，混匀，冰上孵育5-10min。
2. 人样本，每100 µl染色体积加入5µl Human TruStain FcX™ (Fc Receptor Blocking Solution，Fc受体封闭剂)，混匀，室温孵育5-10min。在不含有有效/可得的封闭抗体情况下，使用过量的相同物种来源的纯化IgG和免疫荧光染色用抗体相同来源的IgG亚型作为替代方法来封闭细胞。

D．抗体的细胞表面染色

1. 按照预先优化的浓度，加入合适的荧光素、生物素偶联抗体或纯化的一抗（如： anti-CD3-FITC, anti-CD4-Biotin, and anti-CD8-APC），冰上避光孵育15-20min。
2. 至少使用2ml细胞染色缓冲液（cell staining buffer）清洗细胞，350xg离心5min，吸掉上清。重复一次。
3. 如果使用纯化的一抗，需在残留的缓冲液中重悬细胞，加入预先优化浓度的荧光二抗，冰上避光孵育15-20min。
4. 重复步骤10。
5. 用0.5ml细胞染色缓冲液（cell staining buffer）重悬细胞，每10⁶个细胞加入5µl（0.25µg）7-AAD染色液（ 7-AAD Viability Staining Solution）对死细胞染色。
6. 避光冰上孵育3-5min。
7. 用流式细胞仪分析结果。【注意】：如果不能立即使用流式细胞仪分析样品，避光保存样品，并且置于4-8℃保存。样品必须重悬于细胞染色液中。注意细胞样品不应该放在固定缓冲液更长时间，因其会影响荧光素构象和荧光信号。

实验材料：