酵母双杂交检测（Yeast Two-Hybrid Assay）产品专题 

检测原理：

酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid assay）是用于体内研究蛋白相互作用的一种非常便利的工具，常用的如GAL4为基础的系统，使用酵母转录因子GAL4来检测转录激活后的蛋白相互作用。某些转录因子（如GAL4）由两个可以分开，功能上相互独立的结构域组成，N端有一个147个氨基酸组成的DNA结合域（DNA binding domain，BD），C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域（transcription activation domain，AD）。BD可以和上游激活序列（UAS）结合，而AD能激活UAS下游基因进行转录。单独的BD或AD不能激活基因转录，两者只有通过某种方式结合在一起形成完整的转录激活因子的功能【见图1】。酵母双杂交系统主要利用酵母GAL4的这个特性通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋白质的相互作用，对蛋白质之间微弱、瞬间的作用都能通过报告基因敏感的检测到。

酵母双杂交系统应用：

1. 对新的与已经蛋白相互作用的鉴定
2. 对预测蛋白相互作用的确认
3. 对蛋白相互作用区域的鉴定

图1. 双杂交检测原理图。两个蛋白分别表达，一个（诱饵蛋白bait protein）融合到Gal4 DNA结合域表达，另一个（诱捕蛋白prey protein）融合到Gal4转录激活结构域（AD）表达。在Y2HGold酵母菌株中，只有当两个蛋白之间相互作用并结合到Gal4反应性启动子上才能活化报告基因（AUR1-C, ADE2, HIS3, 和MEL1）的表达。

酵母双杂交系统操作流程（以Clontech Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例）

完整的Matchmarker筛选过程包含以下步骤：

*步：执行对照实验；

第二步：诱饵载体的构建及自我激活和毒性检测；

第三步：筛选Mate&Plate文库

第四步：确认和阐释结果

图3. 使用Mate&Plate文库进行双杂交筛选。捕获蛋白（bait protein）是酵母菌Y2HGold表达的Gal4 DNA-BD融合蛋白。高复杂性文库表达Gal4 AD融合蛋白，由Y187酵母菌提供。当两种转化菌株混合过夜能接合产生二倍体（Diploids）。此二倍体含有4个报告基因：HIS3，ADE2，MEL1和AUR1-C，受双杂交作用而活化表达。

酵母双杂交检测需要产品信息：

我司（懋康生物）提供酵母双杂交研究需要的一系列产品，从酵母菌株、酵母质粒、酵母培养基到筛选标志（抗生素），咨询，，：2971634497。

一、富集培养基（Rich Medium 酵母培养）

【补充描述】：

1. YPD是用于大多数酵母菌生长所需的酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖优化配比后组成的混合物；
2. YPDA培养基是在YPD基础上添加硫酸腺嘌呤，终浓度120 µg/ml。

二、基本培养基（Minimal Medium 酵母培养）

【补充描述】：

1. SD Medium：酵母菌用的基本的合成限定培养基（Minimal synthetically defined medium），包含氮源，碳源（葡萄糖，除非有特殊说明）和DO添加剂（Dropout Supplement）。
2. DO（Dropout Supplement or Solution）：特定氨基酸和核苷的混合物，添加到SD base内以配制SD Medium。DO缺少一种或者更多未转化酵母菌需要的营养成分使其在SD Medium上生长，作为营养筛选标志。

三、省却成分氨基酸混合物（DO Supplements 酵母培养）

四、筛选抗生素（底物）

【补充描述】：

1）Aureobasidin A （AbA）金担子素A是报告基因AUR1-C的筛选抗生素，以判断酵母菌是否能表达赋予其AbA抗性的酶。

2）X-α-Gal是α-半乳糖苷酶（由MEL1基因编码）的底物，当双杂交发生时MEL1报告基因正常表达催化底物发生颜色反应，使得酵母菌落呈蓝色。

3）X-Gal是ß-半乳糖苷酶（由lacz基因编码）的底物。

五、酵母质粒提取试剂盒

【试剂盒工作原理】：

该试剂盒把硅胶柱纯化技术同经典的SDS碱裂解法结合起来，用户可在1小时内从酵母培养液中纯化出高纯度的质粒DNA。纯化过程不需用任何到有害的有机物抽提，亦不需用到耗时的乙醇沉淀。质粒DNA的产量依赖于酵母携带质粒的拷贝数，酵母菌株以及生长条件。 一般来说，酵母质粒的拷贝数较低，5.0ml过夜培养液中质粒DNA产量约为1.0 µg左右。纯化的质粒可直接用于酶切，PCR,电转化等应用。酵母收集后,加入破壁酶和玻璃珠去除细胞壁,用传统碱裂法裂解细胞，然后将获得的上清液转移至结合柱结合DNA，经过两次快速洗涤，zui后用无菌水洗脱出质粒DNA。

六、酵母转化试剂盒

【补充描述】：

酵母质粒转化试剂盒，含PEG/liAC酵母转化需要的所有试剂，操作简单，转化效率高。

七、酵母双杂交菌和感受态细胞

八、酵母菌载体

 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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