细胞凋亡检测试剂

TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)

细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光）

产品信息

产品描述

细胞凋亡时，细胞内特异性核酸内切酶活化，染色质DNA在核小体间被特异性切割，DNA降解成180~200 bp或其它整数倍片段。本试剂盒采用TUNEL（TdTmediated dUTP Nick End Labeling）法，工作原理在于：DNA分子断裂产生的3´-羟基（3´-OH）末端可以在末端脱氧核糖核苷酸转移酶（TdT, Terminal Deoxynucleotidyl Transferase）的催化下结合荧光素-12-脱氧三磷酸尿苷（FITC-12-dUTP），FITC-12- dUTP标记的DNA可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量分析，从而反映细胞凋亡水平。

本试剂盒对标记反应进行了优化，采用最佳比例的荧光素标记和未标记的dNTP进行3’-OH末端的核苷酸掺入，使得同一个断裂的DNA片段末端可以形成更长的“标记尾巴"，该“标记尾巴"减少了相邻掺入dNTP上标记基团的空间位阻，增加了每个断裂片段末端的荧光基团数目，降低了荧光基团相邻后可能造成的聚集和淬灭，从而提高检测灵敏度，减少非特异性反应。

本试剂盒应用广泛，适用于检测冰冻切片、石蜡切片，贴壁细胞以及悬浮细胞的凋亡情况。

产品组成

保存与运输方法

保存：-20℃保存，1年有效。注意：FITC-12-dUTP Labeling Mix（MX3216-B）需避光保存。

运输：冰袋运输。

注意事项

1） 极少数细胞凋亡不会发生DNA断裂，此时不适用于TUNEL法检测。另，少数类型的坏死细胞中也可能发现DNA断裂，检测出TUNEL阳性。如果实验要求严格判定细胞凋亡，建议同时检测多个凋亡指标，比如Annexin V早期凋亡检测，Caspase凋亡蛋白活性检测。

2） 荧光物质易发生淬灭，试剂储存和操作过程中尽量避光。荧光检测时也尽量缩短观察时间。

3） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法（TUNEL染色）

一、 石蜡包埋组织切片的实验流程

1.1样本预处理（石蜡包埋组织切片）

1.1.1 室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡5~10min，重复一次，以彻di脱掉石蜡。

1.1.2 室温下用无水乙醇浸泡切片5min，重复一次。

1.1.3室温下用梯度乙醇（90%、80%、70%）各浸泡润洗1次，每次3min。

1.1.4用PBS浸泡润洗切片，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。

1.1.5 按照1:100的比例，用PBS稀释2mg/ml的Proteinase K溶液，使其终浓度为20μg/ml。每个样本上滴加100μl稀释好的Proteinase K溶液（20μg/ml），使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育20min。

1.1.6用PBS浸泡润洗样本3次，每次5min，轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持湿润。

1.2【可选步骤】阳性对照-DNase I处理

【注意：仅阳性对照进行此步骤，其他样本直接进入步骤1.3标记及检测】

1.2.1按1:10的比例，用ddH2O稀释10× DNase I Buffer到1× DNase I Buffer备用。

1.2.2滴加100μl 1× DNase I Buffer到已通透的样本上，室温平衡5min。

1.2.3用1× DNase I Buffer稀释DNase I (2 U/μl=2000 U/ml)，使其终浓度为20 U/ml。

1.2.4轻轻洗掉样本上的多余液体，滴加100μl 稀释好的DNase I（20 U/ml）工作液，室温孵育10min。

1.2.5轻轻洗掉多余液体，并且将切片放入装有PBS的染色缸中彻di浸泡润洗2~3次。

1.3标记及检测

1.3.1按1:5的比例，用ddH2O稀释5×Equilibration Buffer到1×Equilibration Buffer。

1.3.2每个样本滴加100μl 1×Equilibration Buffer，使其覆盖全部待检区域，室温平衡10~30min。

1.3.3平衡期间于避光条件下按照下表配制标记反应液。

1.3.4平衡结束后，用吸水纸吸掉1×Equilibration Buffer，然后在样本上滴加50μl 新鲜配制的标记反应液，注意避光。

1.3.5在避光的黑色湿盒底部放上用水浸湿的纸巾。将载玻片置于湿盒内，37℃孵育60min。

1.3.6轻轻去掉多余液体，用新鲜的PBS清洗2次，每次室温孵育5min。

1.3.7用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的PBS溶液。

1.3.8用新鲜配制的PI溶液（1μg/ml in PBS）或DAPI溶液（2μg/ml in PBS）在黑暗中对样本进行复染，室温避光孵育5min。

1.3.9洗涤样本，将载玻片浸入PBS溶液中清洗3次，每次5min。

1.3.10轻轻洗掉多余液体，并且向样本区域滴加适量抗荧光淬灭剂，进行封片。

1.3.11立即在荧光显微镜下分析样本，在517nm荧光下观察绿色荧光，在＞620nm荧光下观察PI的红色荧光，或在460nm处观察DAPI的蓝色荧光。

二、 冰冻组织切片的实验流程

2.1样本预处理（冰冻组织切片）

2.1.1 将冰冻切片置于片架上，室温晾干20min。

2.1.2 将玻片浸没在4%多聚甲quan溶液（溶于PBS）（比如：MM1504-100ML）中固定，室温固定30min。

2.1.3轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。

2.1.4将玻片浸没在PBS溶液中清洗两次，每次5min。

2.1.5轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。

2.1.6用PBS制备0.2% Triton X-100。每个样本上滴加100μl 0.2% Triton X-100，使其覆盖全部样本区域，室温孵育15min。如果通透效果不好，则：按照1:100的比例，用PBS稀释2mg/ml的Proteinase K溶液，使其终浓度为20μg/ml。每个样本上滴加100μl稀释好的Proteinase K溶液（20μg/ml），使其覆盖全部样本区域，室温孵育10min。

2.1.7用PBS溶液润洗样本2-3次，每次5min，轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保持湿润。

2.2 【可选步骤】阳性对照-DNase I处理

【注意：仅阳性对照进行此步骤，其他样本直接进入步骤2.3标记及检测】

2.2.1按1:10的比例，用ddH2O稀释10× DNase I Buffer到1× DNase I Buffer备用。

2.2.2滴加100μl 1× DNase I Buffer到已通透的样本上，室温平衡5min。

2.2.3用1× DNase I Buffer稀释DNase I (2 U/μl=2000 U/ml)，使其终浓度为20 U/ml。

2.2.4轻轻洗掉样本上的多余液体，滴加100μl 稀释好的DNase I（20 U/ml）工作液，室温孵育10min。

2.2.5轻轻洗掉多余液体，并且将切片放入装有PBS的染色缸中彻di浸泡润洗2~3次。

2.3标记及检测

2.3.1按1:5的比例，用ddH2O稀释5×Equilibration Buffer到1×Equilibration Buffer。

2.3.2每个样本滴加100μl 1×Equilibration Buffer，使其覆盖全部待检区域，室温平衡10~30min。

2.3.3平衡期间于避光条件下按照下表配制标记反应液。

2.3.4平衡结束后，用吸水纸吸掉1×Equilibration Buffer，然后在样本上滴加50μl 新鲜配制的标记反应液，注意避光。

2.3.5在避光的黑色湿盒底部放上用水浸湿的纸巾。将载玻片置于湿盒内，37℃孵育60min。

2.3.6轻轻去掉多余液体，用新鲜的PBS清洗2次，每次室温孵育5min。

2.3.7用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的PBS溶液。

2.3.8用新鲜配制的PI溶液（1μg/ml in PBS）或DAPI溶液（2μg/ml in PBS）在黑暗中对样本进行复染，室温避光孵育5min。

2.3.9洗涤样本，将载玻片浸入PBS溶液中清洗3次，每次5min。

2.3.10轻轻洗掉多余液体，并且向样本区域滴加适量抗荧光淬灭剂，进行封片。

2.3.11立即在荧光显微镜下分析样本，在517nm荧光下观察绿色荧光，在＞620nm荧光下观察PI的红色荧光，或在460nm处观察DAPI的蓝色荧光。

三、 贴壁细胞的实验流程

3.1样本预处理（贴壁细胞）

3.1.1实验前准备

◇ 细胞爬片的准备

在Lab-Tek载玻片小室或TC处理的细胞爬片上培养贴壁细胞。在凋亡诱导处理之后，用PBS清洗载玻片2次，进入后续实验。

◇ 细胞涂片的制备

以2×106 cells/ml的浓度将细胞重悬于PBS中。吸取50~100 μl 细胞悬液滴于多聚赖氨酸包被的载玻片上。用一片干净的载玻片轻柔的涂开细胞悬液，进入后续实验。

3.1.2 将爬片或涂片浸入装有4%多聚甲醛（溶于PBS）（比如：MM1504-100ML）的染色缸中，4℃放置25min，以固定细胞。

3.1.3 将爬片或涂片浸入PBS中清洗2次，每次室温放置5min。

3.1.4 轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干爬片或涂片上样本周围多余的液体。

3.1.5 将爬片或涂片浸入0.2% Triton X-100（in PBS），室温孵育5min进行通透处理。

3.1.6用PBS润洗样本2-3次，每次3-5min，轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保存湿润。

3.2【可选步骤】阳性对照-DNase I处理

【注意：仅阳性对照进行此步骤，其他样本直接进入步骤3.3标记及检测】

3.2.1按1:10的比例，用ddH2O稀释10× DNase I Buffer到1× DNase I Buffer备用。

3.2.2滴加100μl 1× DNase I Buffer到已通透的样本上，室温平衡5min。

3.2.3用1× DNase I Buffer稀释DNase I (2 U/μl=2000 U/ml)，使其终浓度为20 U/ml。

3.2.4轻轻洗掉样本上的多余液体，滴加100μl 稀释好的DNase I（20 U/ml）工作液，室温孵育10min。

3.2.5轻轻洗掉多余液体，并且将爬片或涂片放入装有PBS的染色缸中彻di浸泡润洗2~3次。

3.3标记及检测

3.3.1按1:5的比例，用ddH2O稀释5×Equilibration Buffer到1×Equilibration Buffer。

3.3.2每个样本滴加100μl 1×Equilibration Buffer，使其覆盖全部待检区域，室温平衡10~30min。

3.3.3平衡期间于避光条件下按照下表配制标记反应液。

3.3.4平衡结束后，用吸水纸吸掉1×Equilibration Buffer，然后在样本上滴加50μl 新鲜配制的标记反应液，注意避光。

3.3.5在避光的黑色湿盒底部放上用水浸湿的纸巾。将载玻片置于湿盒内，37℃孵育60min。

3.3.6轻轻去掉多余液体，用新鲜的PBS清洗2次，每次室温孵育5min。

3.3.7用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的PBS溶液。

3.3.8用新鲜配制的PI溶液（1μg/ml in PBS）或DAPI溶液（2μg/ml in PBS）在黑暗中对样本进行复染，室温避光孵育5min。

3.3.9洗涤样本，将载玻片浸入PBS溶液中清洗3次，每次5min。

3.3.10轻轻洗掉多余液体，并且向样本区域滴加适量抗荧光淬灭剂，进行封片。

3.3.11立即在荧光显微镜下分析样本，在517nm荧光下观察绿色荧光，在＞620nm荧光下观察PI的红色荧光，或在460nm处观察DAPI的蓝色荧光。

四、 悬浮细胞的实验流程

4.1将（3~5）×106个细胞用PBS清洗2次，每次于4℃，1800rpm（300×g）离心5min，然后，用0.5mlPBS重悬。

4.2加入5ml 1%多聚甲醛（in PBS），4℃孵育20min进行细胞固定。

4.3于4℃，1800rpm（300×g）离心5min，弃上清，用5ml PBS重悬细胞。

4.4重复离心并用0.5ml PBS重悬细胞。

4.5加入5ml 0.2% Triton X-100（in PBS），室温通透5min；或加入5ml冰上预冷的70%乙醇，在-20℃孵育4h。

4.6于4℃，1800rpm（300×g）离心5min，弃上清，用5ml PBS重悬细胞。重复离心并用1ml PBS重悬细胞。

4.7转移2×106个细胞到新的1.5ml离心管。

4.8于4℃，1800rpm（300×g）离心5min，弃上清，并且用100μl 1×Equilibration Buffer【于使用前，按1:5的比例用ddH2O稀释5×Equilibration Buffer】重悬细胞。室温孵育5min。

4.9平衡期间于避光条件下按照下表配制标记反应液。冰上融化FITC-12-dUTP Labeling Mix。

4.10于4℃，1800rpm（300×g）离心5min，弃上清，用50μl 新鲜配制的标记反应液重悬细胞。37℃避光孵育60min，每隔15min轻弹管壁或用微量移液器轻轻重悬细胞。

4.11加入1ml 20mM EDTA终止反应，用移液器轻柔混匀。

4.12于4℃，1800rpm（300×g）离心5min，弃上清，用1ml 0.1% Triton X-100（in PBS）+5mg/ml BSA重悬细胞，重复1次，共洗2次。

4.13于4℃，1800rpm（300×g）离心5min，弃上清，用0.5ml新鲜配制的PI溶液（5μg/ml in PBS）重悬细胞，其中含250μg RNase A（DNase-free）。

4.14在黑暗中室温孵育细胞30min。

4.15用流式细胞仪分析细胞。或用标准的荧光滤片装置来分析细胞。在517nm荧光下观察绿色荧光，在＞620nm荧光下观察PI的红色荧光。

使用方法（TUNEL和免疫荧光共染）

一、 石蜡组织切片的共染步骤

二、 冰冻组织切片的共染步骤

三、 细胞爬片的共染步骤

常见问题

1. 阳性细胞数量少

通透不充分，可通过调整蛋白酶K或Triton X-100的孵育时间优化通透步骤。

2. 高背景（如未凋亡细胞的强绿色荧光背景）

非特异性掺入FITC-12-dUTP。处理方法：在操作过程中保持细胞润湿；标记反应完成，载玻片在用PBS洗一次后，可再用含0.1% Triton X-100和5mg/ml BSA的PBS洗3次，每次5min。

3. 组织切片从载玻片上脱落

组织切片粘附之前的包被不充分。在展片之前，用3-氨丙基三乙氧基硅烷（TESPA）包被显微镜载玻片，比多聚赖氨酸（PLL）的效果更好。

4. 显微镜或流式细胞仪分析只剩下很少的细胞

在操作过程中丢失大量细胞，处理方法：1）可以提高起始的细胞量；2）在制备细胞悬液时，离心过程中用含1% BSA的PBS清洗细胞。

5. 标记率低

如果以乙醇或甲醇固定的样本，则标记效率较低。原因是：固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失。应该用4%多聚甲醛（in PBS）或福尔马林或戊二醛固定。

过度的固定导致与蛋白质过度交联，也会导致标记效率低。可以适当缩短固定时间。或用2%多聚甲醛（in PBS）固定。

6. 假阳性

某些肌组织的冰冻切片，如果制片过程中没有经过多聚甲醛固定，容易出现内源性核酸酶切割DNA导致假阳性，应该将组织取出后及时用多聚甲醛固定，另外，尽量避免用蛋白酶K通透。

蛋白酶K工作液处理时间、温度需摸索最适条件，温度过高，时间过长，容易破坏核酸结构，出现假阳性。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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