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农杆菌化学感受态细胞 克隆与表达

农杆菌化学感受态细胞 克隆与表达

简要描述:

农杆菌化学感受态细胞 克隆与表达EHA105菌株由EHA101菌株改造而来,染色体背景为C58,核基因含筛选标签—利fu平抗性基因rif,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pEHA105(pTiBo542DT-DNA),此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件 质粒自身的T-DNA转移功能虽被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DN

产品时间:2024-06-25

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EHA105(pSoup) Chemically Competent Cell

农杆菌化学感受态细胞

 


产品标签:

EHA105菌株;农杆菌感受态细胞;Rifampicin(Rif) 利fu平;Kanamycin(kan)卡那mei素;EHA101;LBA4404;GV3101;AGL1;植物转基因研究;

 

产品订购:更大包装或产品技术问题,

货号

产品名称

规格

价格(元)

MF2473-1000UL

EHA105(pSoup) Chemically Competent Cell农杆菌电转感受态细胞

10×100μl

288

MF2473-5000UL

EHA105(pSoup) Chemically Competent Cell农杆菌电转感受态细胞

50×100μl

1228

 

产品描述:

EHA105菌株由EHA101菌株改造而来,染色体背景为C58,核基因含筛选标签—利fu平抗性基因rif,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pEHA105(pTiBo542DT-DNA),此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件,pEHA105(pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能虽被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。在EHA105菌株中转入help质粒:pSoup,即得到:EHA105 (pSoup)菌株,可帮助pGreen,62SK,pGs2系列质粒在农杆菌中复制,同时赋予该菌株四环素(tetR)抗性,适用于水稻、烟草等植物的转基因操作。

我司(懋康生物)提供的EHA105 (pSoup)化学转化感受态细胞经特殊工艺制作,基因型为C58 (rifR) Ti pEHA105 (pTiBo542DT- DNA) Succinamopine (pSoup-tetR),经pGs2质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。

 

产品组分:

组分编号

组分名称

货号(规格)

MF2473-1000UL

MF2473-5000UL

MF2473-A

EHA105(pSoup)Chemically Competent Cell

10×100μl

50×100μl

MF2473-B

pGs2 Control Vector (10ng/μl)

10μl

10μl

 

保存与运输条件:

保存:-80℃保存,1年有效。

运输:干冰运输。

 

注意事项

1) 感受态细胞应保存在-80℃,不可反复冻融和放置时间过长,以免降低感受态细胞的转化效率。

2) 整个转化操作,严格根据相应温度及无菌条件要求进行。

3) 加入质粒的体积不应大于感受态体积的1/10。质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,会导致转化效率急剧下降。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。

4) 为确保最高转化效率,整个操作过程应尽量轻柔,并保持低温。

5) 转化高浓度的质粒可相应减少最终涂板用量。

6) 平板上克隆密度过大时,由于营养不足,克隆生长变慢,菌落变小。为获得大菌落,应减少质粒用量。

7) 培养基中加入利fu平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入链mei素或庆大mei素可防止Ti质粒丢失,但链mei素不利于农杆菌的转基因操作,一般培养农杆菌时不考虑链mei素或庆大mei素,因Ti质粒丢失的概率极低(基本可以忽略)

8) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。


使用方法

1) 取-80℃保存的感受态细胞于室温或手心片刻待其部分融化,达到冰水混合状态时插入冰浴中使其完quan融化。

2) 往100μl感受态细胞悬液中加入0.01~1μg(体积不大于10μl)质粒DNA,用手拨da管底使其混匀,依次于冰上静置5min,液氮5min,37℃水浴5min,冰浴5min。

【注意】第一次使用,建议做预实验确定所加质粒的用量

3) 加入700μl无抗生素的LB或YEB液体培养基,于28℃振荡培养2-3h。

4) 6,000rpm离心1min,吸掉600ul上清,之后用枪轻轻吹打重悬菌体。之后加到含相应抗生素的LB或YEB平板上,用无菌玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。室温正置10 min,待液体被吸收后,倒置平板,28℃培养2-3天。

【注意】:当平板只含50μg/ml卡那mei素时,28℃培养48h即可;当平板中同时加入50μg/ml卡那mei素和10μg/ml利fu平时,需28℃培养48-60h;当平板中同时加入50μg/ml卡那mei素和20μg/ml利fu平时,需28℃培养60-72h;不建议使用超过20μg/ml的利fu平用于平板或液体培养。

5)目的克隆的液体培养:

j小量摇菌:往15ml的圆底透气试管中加入1ml含对应抗生素的LB液体培养基,从新鲜培养的平板上挑1-2个单菌落接种,30℃,200rpm摇菌24-48h。

k大量摇菌:100ml透气三角瓶内加入少于20ml含对应抗生素的LB液体培养基,取小摇菌液按2%比例接菌,30℃,200rpm摇菌24-48h。


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Spectinomycin Dihydrochloride Pentahydrate壮观mei素二盐suan盐五水合物

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5g

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Carbenicillin, Disodium Salt羧苄青mei素二钠盐

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10g

MS0019-25G

Kanamycin Sulfate硫酸卡那mei素

25g

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1g

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Streptomycin Sulfate, USP Grade硫酸链mei素

25g


附表1固体和液体LB培养基配方

组分Component

LB(液体)/升

LB(固体)/升

胰蛋白胨Tryptone

10g

10g

酵母提取物Yeast extract

5g

5g

氯化钠NaCl

10g

10g

1N NaOH

调整pH至7.0

调整pH至7.0

琼脂Agar

/

15g


附表2固体和液体YEB培养基配方

组分Component

YEB(液体)/升

YEB(固体)/升

胰蛋白胨Tryptone

5g

5g

酵母提取物Yeast extract

1g

1g

牛肉浸膏Beef Extract

5g

5g

蔗糖Sucrose

5g

5g

七水硫suan镁MgSO4·7H2O

0.49g

0.49g

1N NaOH

调整pH至7.0

调整pH至7.0

琼脂Agar

/

15g


附表3常见农杆菌对抗生素敏感性总表

农杆菌菌株

羧苄(carb)

链mei素(strep)

利fu平(rif)

庆大mei素(gent)

卡那mei素(kan)

EHA101

S

S

R

S

R

EHA105

S

S

R

S

S

LBA4404

S

R

R

S

S

GV3101

S

S

R

R

S

AGL1

R

S

R

S

S

【备注】:S代表敏感,R代表抗性。

 

 

 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

 

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