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Caspase-8活性检测试剂盒 细胞增殖

Caspase-8活性检测试剂盒 细胞增殖

简要描述:

Caspase-8活性检测试剂盒 细胞增殖Caspases(Cysteine-requiring Aspartate Proteases)是一个高度保守的半胱an酸蛋白酶家族,特异性识别底物中的天冬氨酸残基,在介导细胞凋亡的过程中发挥着非常重要的作用。

产品时间:2024-05-28

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Caspase-8 Activity Assay Kit (Fluorometric)

Caspase-8活性检测试剂盒(荧光法)


产品信息

产品名称

产品编号

规格

价格(元)

Caspase-8活性检测试剂盒(荧光法)

MX3233-20T

20T

930

Caspase-8活性检测试剂盒(荧光法)

MX3233-100T

100T

2980


产品描述

Caspases(Cysteine-requiring Aspartate Proteases)是一个高度保守的半胱an酸蛋白酶家族,特异性识别底物中的天冬氨酸残基,在介导细胞凋亡的过程中发挥着非常重要的作用。Caspases以潜在酶原的形式表达,通过自发蛋白分解机制或经其他蛋白酶(通常是其他caspases)加工处理的方式被活化。人caspases可细分为三大功能组:细胞因子活化(caspase-1,-4,-5和-13),凋亡启动(caspase-2,-8,-9和-10)和凋亡执行(caspase-3,-6和-7)。

Caspase-8(Caspase 8),也称为Mch5,MACH和FLICE,位于caspase级联层次结构的顶端,是“上游"成员或caspases的启动家族。以无活性酶原的形式存在细胞内,分子量55kDa。一旦募集到死亡受体胞浆结构域(比如Fas),通过配体蛋白FADD,即被激活,形成一个由18kDa和12kDa亚基组成的二聚体,进一步激活下游的caspases(-3,-6和-7),进而切割关键的细胞底物,导致细胞凋亡性死亡。

Caspase-8活性检测试剂盒(荧光法)(Caspase-8 Activity Assay Kit, Fluorometric or Caspase-8 Fluorometric Assay Kit)以偶联上发色基团AFC的caspase-8序列特异性的多肽为底物。当底物被caspase-8剪切后,发色基团被释放出来,进而用荧光酶标仪来测定其荧光强度(激发波长=485nm,发射波长=535nm)。通过计算RFU凋亡诱导组/RFU阴性对照组的比值来确定凋亡诱导组caspase-8的活化程度。

本品适用于培养细胞以及新鲜组织的caspase-8活性检测。


产品包装

编号

组分名称

保存方法

货号(规格)

MX3233-20T

MX3233-100T

MX3233-A

Lysis Buffer 裂解缓冲液

2-8℃

5ml

20ml

MX3233-B

2× Reaction Buffer 2×反应缓冲液

2-8℃

2ml

10ml

MX3233-C

Caspase-8 Substrate Caspase-8底物

-20避光

6μl

30μl

MX3233-D

0.1M DTT

-20避光

60μl

250μl


保存与运输方法

保存:-20℃保存,1年有效。开盒后置Lysis Buffer和2× Reaction Buffer于2-8℃保存。Caspase-8 Substrate和0.1M DTT需要避光冻存。

运输:冰袋运输。


注意事项

1) Caspase-8 Substrate需避光保存和使用。

2) 某些凋亡诱导剂诱导的凋亡可能通过caspase-8非依赖的方式进行,此种情况使用本品检测的caspase-8活性无明显变化,则,需要考虑凋亡机制中的其他信号通路。

3) 起始细胞数量需达3~5×106个或新鲜组织量达50~100mg,以保证达到测定所需的100~200μg蛋白量。Caspase-8的活性与细胞裂解后的蛋白含量有关,如测定的RFU值偏低,可通过适当延长反应时间来操作。但如果测定的RFU值依然不高,则要通过增加细胞数量或组织量的方法来提高蛋白量。

4) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。


使用方法

1需要的其他试剂和材料

仪器:低温高速离心机、荧光酶标仪、微量移液器、玻璃匀浆器(组织样本)

耗材:1.5ml微量离心管、白色或黑色(不透明、平底)的96孔酶标板

试剂:PBS、蛋白定量试剂(比如:Bradford法蛋白浓度测定试剂盒)、ddH2O


2试剂准备

2.1 Lysis Buffer(含DTT

于实验前,按每50μl Lysis Buffer 加入0.5μl DTT的比例准备足量的裂解工作液,置于4℃或冰上待用。

2.2 Reaction Buffer(含DTT

于使用前,按每50μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl DTT的比例准备足量的反应工作液。

2.3 Caspase-8 Substrate工作液

将Caspase-8 Substrate从冰箱内取出,置于室温(或25℃水浴)使其充分融化,低速离心使其沉至管底。于使用前,按照19.5μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl Caspase-8 Substrate的比例准备足量的Caspase-8 Substrate工作液。


3样本准备

3.1 细胞裂解

a)用合适方法诱导细胞凋亡,同时设立阴性对照组(不加诱导剂),收集3~5×106个细胞。

b)PBS洗涤细胞2次(2000rpm,离心5min),尽量吸尽PBS上清。

c)往离心的沉淀细胞中加入100μl预冷的Lysis Buffer(含DTT,吹打混匀。

d)置冰上裂解20~60min,其间涡旋振荡3~4次,每次10s;或冻融2~3次。

e)4℃,10,000rpm离心1min。

f)小心吸取上清(含裂解释放的蛋白质)转移到新的EP管内,置于冰上待用。

g)取少量上清(1~2μl),用常规方法(Bradford法)测定蛋白浓度。

3.2 组织裂解

a)取50~100mg组织置于培养皿内,用手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块,加入150~200μl预冷的Lysis Buffer(含DTT,用玻璃匀浆器上下手动匀浆15次,注意低温操作。

b)将组织匀浆液转移到1.5ml预冷的离心管,10,000rpm,4℃离心5min。

c)小心吸取上清(含裂解释放的蛋白质)转移到新的EP管内,置于冰上待用。

d)取少量上清(1~2μl),用常规方法(Bradford法)测定蛋白浓度。

4Caspase-8活性检测

 

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