K599(pSoup) 农杆菌化学感受态细胞表达分析

K599(pSoup) Chemically Competent Cell

农杆菌化学感受态细胞

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发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）是根瘤菌科农杆属的一种革兰氏阴性土壤细菌，能够侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。起关键作用的是其携带的Ri质粒，含有负责发根自主性生长和冠瘿碱合成的基因。结构上于Ti质粒类似，主要有致毒区（Vir），T-DNA区以及冠瘿碱合成功能区等。

根据合成冠瘿碱的不同，Ri质粒分为4种类型：1）甘露碱型；2）黄瓜碱型；3）农杆碱型；4）米奇矛型。

发根农杆菌菌株K599（NCPPB2659）含有pRi2659农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围（葫芦科，豆科，茄科等），同时具有链mei素抗性。在K599菌株中转入help质粒：pSoup，即为K599(pSoup)菌株，可帮助pGreen，62SK，pGS2系列质粒在农杆菌中复制，同时赋予该菌株四环素（tet）抗性。

我司（懋康生物）提供的K599(pSoup)化学转化感受态细胞经特殊工艺制作，基因型为Agrobacterium rhizogenes (strR ) pRi2659 (agropine type)(pSoup-tetR)，经pGs2质粒（卡那mei素抗性）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，一年有效。 

运输：干冰运输。

注意事项

1） 感受态细胞应保存在-80℃，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。

2） 整个转化操作，严格根据相应温度及无菌条件要求进行。

3） 加入质粒的体积不应大于感受态体积的1/10。质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，会导致转化效率急剧下降。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

4） 混匀质粒时应用手指快速拨da管底或用枪吹吸混匀，务必使质粒快速、均匀分散开，与感受态细胞充分接触。

5） 转化高浓度的质粒可相应减少最终涂板用量。

6） 平板上克隆密度过大时，由于营养不足，克隆生长变慢，菌落变小。为获得大菌落，应减少质粒用量或降低涂板的菌量。

7） K599(pSoup)具有链mei素、四环素抗性，不可用于具链mei素、四环素抗性质粒的转化。

8） K599(pSoup)对壮观mei素不敏感，若转化具壮观mei素抗性的质粒，务必使用TY培养基（配方见附表1），且壮观mei素的工作浓度在100~150μg/ml，过低浓度的壮观mei素会产生糊板现象，难以长出阳性克隆；当使用壮观emi素（100~150μg/ml）筛选，能长出阳性克隆，但平板底部可能会有一层薄的菌膜，属于正常现象。

9） 为了保证最佳的转化效率，发根农杆菌的培养务必使用TY培养基（配方见附表1）。

10） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1) 取-80℃保存的感受态细胞于室温或手心片刻待其部分融化，达到冰水混合状态时插入冰中。

2) 往100μl感受态细胞悬液中加入0.01~1μg质粒DNA（转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），用手快速拨da管底混匀或用枪吹吸混匀，依次放于冰中间静置5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min。

3) 冰浴中拿出放室温，加入700μl无抗生素的TY液体培养基，于28℃，200rpm振荡培养2h。

4) 6,000rpm离心1min，吸掉600ul上清，之后用枪轻轻吹打重悬菌体。之后加到含相应抗生素的TY平板上，用无菌玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。室温正置10 min，待液体被吸收后，倒置平板，28℃培养2-3天。

附表1固体和液体TY培养基配方

附表2常见发根农杆菌对抗生素敏感性总表

附表3常见农杆菌抗生素配制方法

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