(DE3)大肠杆菌化学感受态细胞表达分析

Rosetta(DE3)pLysS Chemically Competent Cell

大肠杆菌化学感受态细胞

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菌株描述

Rosetta宿主菌是BL21衍生菌，特别设计用于提高含大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达水平，这些菌株补充6种大肠杆菌缺乏的稀有密码子（AGG, AGA, AUA, CUA, CCC, GGA）对应的tRNA，位于兼容的氯霉su抗性质粒上，正因如此，Rosetta菌株提供“通用型"的翻译特征，而不限于大肠杆菌可利用的密码子。

tRNA基因由天然启动子所启动。DE3命名表明该菌株染色体上整合λ噬菌体DE3溶原体（携带lacUV5启动子调控的T7 RNA聚合酶基因）。这种菌株适用于目的基因克隆在pET载体上的蛋白生产，由IPTG诱导表达。pLysS菌株表达T7溶菌mei，其在诱导前进一步抑制T7 RNA聚合酶的基础表达，从而稳定编码影响细胞生长和活力的靶蛋白的pET重组体。

Rosetta(DE3)pLysS菌株基因型：F-ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) pLysSRARE (CamR)

产品描述

本品是大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。经pUC19质粒检测转化效率高于107 cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。

产品包装

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，六个月有效。

运输：干冰运输。

注意事项

1） 感受态细胞必须用干冰运输，感受态细胞应在-80℃保存。

2） 感受态细胞最好在冰上融化，不可在冰上放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

3） 进行转化操作时，需在相应温度及无菌条件下进行。

4） 为防止转化实验不成功，可保留部分连接反应液以重新转化，将损失降到zuidi。

5） 产品包装内含质粒pUC19 DNA(10pg/μl)，供对照实验用。

6） 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

7） 诱导时，IPTG浓度范围可选：0.1~2mM。

8） 为了得到足量的蛋白，需就最佳诱导时间、温度、IPTG浓度进行优化。

9） Rosetta(DE3)pLysS菌株携带pLysSRARE质粒，除复苏培养基为无抗生素外，其余所用培养基，培养液均要加入34µg/ml氯霉su，以防质粒丢失。

10） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在无菌条件的标准下进行】

1） 从-80℃冰箱取出取感受态细胞，迅速置于冰浴中，5min后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物），用手轻弹管底轻轻混匀（避免用枪吸打），冰浴静置25min。

2） 42℃水浴热激45s，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2min。此过程不要摇动离心管。

3） 向每个离心管中加700 μl无菌的LB或2YT培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床，200 rpm振荡培养60min，目的使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

4） 低速离心收菌（比如5000rpm，1min），留取100μl左右上清，用枪轻轻吹打重悬菌块，之后加到含34µg/ml氯霉su和所选质粒筛选抗生素的LB或2YT固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于室温（或37℃）直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养过夜。

【注意】：

a）涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可不用离心，直接取少量转化产物涂布平板；反之，若转化的DNA总量较少，则通过离心（5000 rpm，1min）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。

b）新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。

c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。 

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