大肠杆菌化学感受态细胞表达分析

SHuffle T7 Express lysY Chemically Competent Cell

大肠杆菌化学感受态细胞

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【常见问题】：贵司提供三款SHuffle T7化学感受态细胞，如何选择呢？

基于两种不同的大肠杆菌菌株，有两个版本的SHuffle T7菌株。SHuffle T7（货号：MF2291）是基于大肠杆菌K12改造，而SHuffle T7 Express lysY（货号：MF2289）和SHuffle T7 Express E. coli B（货号：MF2290）是基于大肠杆菌B菌株改造。我们发现，相同蛋白在不同菌株中的折叠和表达水平都有差异，目前来说，无法直接预测哪款菌株能更成功的折叠某一款既定的含二硫键蛋白。因此，我们建议客户在初次实验中，可自行比较目的蛋白在不同菌株中的表达，从而选择更适合的菌株。一旦确定好菌株后，再进行表达条件的优化（比如：温度、诱导强度和时间等）。。

所有的Shuffle菌株都能用于非T7启动子（比如：lac和ara启动子表达载体）。对于T7启动子表达载体，建议要么选择SHuffle T7（货号：MF2291）或SHuffle T7 Express E. coli B（货号：MF2290）。对于毒性T7启动子表达，建议选择SHuffle T7 Express lysY（货号：MF2289）。

菌株描述：

SHuffle T7 Express lysY菌株是SHuffle T7 ExpressE. coliB的衍生菌株，特别设计以增强含多个二硫键蛋白在细胞质内的正确折叠，并且降低本底表达，适合于T7启动子驱动的蛋白表达。

SHuffle T7 Express lysY菌株含lysY质粒（氯mei素抗性），这个质粒含表达T7溶菌mei的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，同时不干扰IPTG的诱导表达，适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。SHuffle T7 Express lysY菌株的染色体中整合一个拷贝的二硫键异构酶基因—DsbC，促进错误氧化的蛋白转化为正确形式。另外，细胞质中的DsbC也是一个分子伴侣，能协助不含二硫键蛋白的正确折叠。该菌株缺少Lon蛋白酶和OmpT蛋白酶，可减少对重组蛋白的降解。

SHuffle T7 Express lysY菌株染色体中整合一个拷贝的T7 RNAP基因，可以表达噬菌体T7 TNA聚合酶，从而适用于T7启动子诱导的蛋白表达。该菌株还能表达大肠杆菌RNA聚合酶，所以可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。SHuffle T7 Express lysY菌株具抵抗噬菌体T1（fhuA2）感染的特点，具链mei素、壮观emi素和氯emi素抗性。

SHuffle T7 Express lysY菌株基因型：MiniF lysY (CamR) /fhuA2 lacZ::T7 gene1 [lon] ompT ahpC gal λatt::pNEB3-r1-cDsbC (SpecR, lacIq) ΔtrxB sulA11 R(mcr-73::miniTn10--TetS)2 [dcm] R(zgb-210::Tn10 --TetS) endA1 Δgor Δ(mcrC-mrr)114::IS10

产品描述

本品是SHuffle T7 Express lysY菌株经特殊工艺制作所得的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。经pUC19载体检测转化效率>1×108cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。

产品组分：

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，六个月有效。

运输：干冰运输。

注意事项

1） 感受态细胞必须用干冰运输。感受态细胞应在-80℃保存（避免温度波动），不可反复冻融且放置时间过长，否则会减低感受态细胞的转化效率。

2） 最好在冰上缓慢融化感受态细胞。不可在冰上放置时间过长，否则会降低转化效率。

3） 进行转化操作时，需在相应温度及无菌条件下进行。

4） 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

5） 为防止转化实验不成功，可保留部分连接反应液以重新转化，将损失降到zui低。

6） 产品包装内含载体pUC19 DNA(10pg/μl)，供对照实验用

7） SHuffle T7 Express lysY菌株具链mei素、壮观emi素、氯emi素抗性，不可用于具链emi素、壮观emi素和氯emi素抗性质粒的转化。

8） 为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间、温度、IPTG浓度（0.1~10mM）都需进行优化。

9） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1） 从-80℃冰箱取出取感受态细胞，迅速置于冰浴中，5min后待菌块融化，加入目的质粒，用手轻弹管底轻轻混匀（避免用枪吹打），冰浴静置25min。

2） 42℃水浴热激45s，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2min。此过程不要摇动离心管。

3） 向每个离心管中加入700 μl无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃ 摇床，200 rpm振荡培养60min，目的使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

4） 低速离心收菌（比如5000rpm，1min），留取50-100μl左右上清，用枪轻轻吹打重悬菌块，之后加到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于室温（或37℃）直至液体被吸收，之后倒置放于37℃过夜培养。

【注意】：

a）涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可不用离心，直接取少量转化产物涂布平板；反之，若转化的DNA总量较少，则通过离心（5,000 rpm，1min）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。

b）新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。

c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

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附表1固体和液体LB培养基配方

附表2 固体和液体2-YT培养基配方

 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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