农杆菌电转感受态细胞 克隆与表达分析

EHA105(pSoup) Electrocompetent Cell

农杆菌电转感受态细胞

产品标签：

EHA105菌株；农杆菌感受态细胞；Rifampicin（Rif） 利fu平；Kanamycin（kan）卡那mei素；EHA101；LBA4404；GV3101；AGL1；植物转基因研究；

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产品描述：

EHA105菌株由EHA101菌株改造而来，染色体背景为C58，核基因含筛选标签—利fu平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pEHA105（pTiBo542DT-DNA），此质粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA105（pTiBo542DT-DNA）质粒自身的T-DNA转移功能虽被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移）。在EHA105菌株中转入help质粒：pSoup，即得到：EHA105 (pSoup)菌株，可帮助pGreen，62SK，pGs2系列质粒在农杆菌中复制，同时赋予该菌株四环素（tetR）抗性，适用于水稻、烟草等植物的转基因操作。

我司（懋康生物）提供的EHA105(pSoup)电转感受态细胞经特殊工艺制作，特别适合大质粒的转化。基因型为C58 (rifR) Ti pEHA105(pSoup) (pTiBo542DT-DNA) Succinamopine(pSoup-tetR)，经pGs2质粒检测转化效率>105cfu/μg DNA。

产品组分：

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，1年有效。

运输：干冰运输。

注意事项

1） 感受态细胞应保存在-80℃，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。

2） 整个转化操作，严格根据相应温度及无菌条件要求进行。

3） 加入质粒的体积不应大于感受态体积的1/10。质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，会导致转化效率急剧下降。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

4） 为确保zui高转化效率，整个操作过程应尽量轻柔，并保持低温。

5） 转化高浓度的质粒可相应减少最终涂板用量。

6） 平板上克隆密度过大时，由于营养不足，克隆生长变慢，菌落变小。为获得大菌落，应减少质粒用量。

7） 培养基中加入利fu平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链mei素或庆大mei素可防止Ti质粒丢失，但链mei素不利于农杆菌的转基因操作，一般培养农杆菌时不考虑链mei素或庆大mei素，因Ti质粒丢失的概率极低（基本可以忽略）

8） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1) 将0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净吸水纸上5min，待其沥干水分，正置5min，使乙醇充分挥发干净，立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖，冰中静置5min使其充分降温。

2) 取-80℃保存的感受态细胞插入冰中5min，待其融化。

3) 往50μl感受态细胞悬液中加入0.01~1μg（体积不大于6μl）质粒DNA，用手bo打管底使其混匀，立即插入冰中。用枪轻轻吹打混匀感受态细胞-质粒之后快速转移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用【注意：由于感受态转化效率较高，di一次使用zuihao做预试验确定zuijia的质粒用量】。

4) 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数参考Bio-rad，具体使用请参考电转仪推荐步骤来操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。

5) 加入700 μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中，于28℃振荡培养2~3h。

6) 6,000rpm离心1min，留取约 100ul上清，之后用枪轻轻吹打重悬菌体。之后加到含相应抗生素的LB或YEB平板上，用无菌玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。室温正置10 min，待液体被吸收后，倒置平板，28℃培养2-3天。【注意：当平板只含转化所用双元载体抗生素时，28℃培养48h即可；当平板中加入双元载体抗生素的同时，再加入10μg/ml利fu平时，需28℃培养48-60h；当平板中加入双元载体抗生素的同时，再加入20μg/ml利fu平时，需28℃培养60-72h;不建议使用超过20μg/ml的利fu平用于平板或液体培养。

7) 目的克隆的液体培养：

j小量摇菌：往15ml的圆底透气试管中加入1ml含对应抗生素的LB液体培养基，从新鲜培养的平板上挑1-2个单菌落接种，30℃，200rpm摇菌24-48h。

k大量摇菌：100ml透气三角瓶内加入少于20ml含对应抗生素的LB液体培养基，取小摇菌液按2%比例接菌，30℃，200rpm摇菌24-48h。

【注意】：对于农杆菌（好氧菌）来说，不论是固体平板还是液体摇菌均需要大量氧气。液体摇菌成功的关键就是要保证培养基中含足够的溶解氧，可通过以下方法来控制：j用透气试管或三角瓶；k确保营养液有大的横截面和小的厚度；l抗生素尽量少加或不加，必须添加的抗生素尽量使用低浓度。

相关产品【感受态细胞系列】

附表1固体和液体LB培养基配方

附表2固体和液体YEB培养基配方

附表3常见农杆菌对抗生素敏感性总表

 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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