大肠杆菌电转感受态细胞 表达分析

DH5α-m Electrocompetent Cell

大肠杆菌电转感受态细胞

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菌株描述

DH5α-m是兼容DH5α和DH10B菌株优点的一款克隆菌株，在其基因组中引入mcrA、mcrBC、mrr-、hsdRMS突变，使得从外源摄入的甲基化DNA不被降解，从而利于甲基化DNA的克隆和扩繁，特别适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA，同时提高了电转效率。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。lacZΔM15的存在使其可用于蓝、白斑筛选。

DH5α-m菌株基因型：F-φ80 lac ZΔM15 Δ(lacZYA-arg F) U169 endA1 recA1 supE44λ- thi -1 gyrA96 relA1 phoA mcrA Δ(mrr- hsdRMS-mcrBC)

产品描述

本品是大肠杆菌DH5α-m菌株经特殊工艺制作所得的电击感受态细胞，只能用于DNA的电击转化，不能用于热激转化。经pUC19质粒检测转化效率＞2×10¹⁰ cfu/μg DNA。且在-80℃能稳定保存几个月转化效率不发生改变。

产品包装

保存与运输条件：

保存：-80℃保存，六个月有效。其中，组分C（S.O.C. Medium）+4℃保存。

运输：干冰运输。

注意事项

1）   感受态细胞最好保存在-80℃以下，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。

2）   整个转化操作，严格根据相应温度及无菌条件要求进行。

3）   加入DNA的体积不应大于感受态体积的1/10。DNA不纯或存在盐、乙醇、蛋白及缓冲液等污染时，会导致转化效率急剧下降。

4）   为确保最高转化效率，整个操作过程应尽量轻柔，并保持低温。

5）   电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。

6）   电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。

7）   若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

8）   对于连接产物转化：最好在转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液重悬产物，保证DNA浓度不超过100ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。

9）   混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时不可用孔径过小的枪头（普通200μl枪头应剪去枪头尖0.6cm）。避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

10）  为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在无菌条件的标准下进行】

【准备工作】：根据每管（50μl）电击感受态需10ml S.O.C.培养基的比例，提前将适量的S.O.C.培养基置于37℃预热1-2h。

1）将0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净吸水纸上5min，待其沥干水分，正置5min，使乙醇充分挥发干净，立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖，冰中静置5min使其充分降温。

2）取-80℃保存的电击感受态细胞插入冰中5min，待其完quan融化。加入目的DNA（质粒或连接产物），用手bo打管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。

【注意】：要测定转化效率，请使用1μl pUC19 Control Vector (10pg/μl)。

【注意】：对于连接产物，部分公司的T4连接酶体系或重组体系不用纯化，可直接与电转感受态细胞混合后进行电击转化，需控制DNA浓度≤100ng/μl，体积≤5μl/50μl感受态细胞。

【注意】：对盐浓度较高的DNA溶液或反应体系需用膜纯化或乙醇沉淀DNA后加入适量ddH2O重悬，然后与电击感受态细胞混合进行电击转化，需控制DNA浓度≤100ng/μl，体积≤5μl/50μl感受态细胞。

3）用200μl枪头（注意所用的枪头用剪刀剪掉0.5cm尖头）轻轻吹打混匀感受态细胞-DNA之后快速转移到电击杯中，避免产生气泡，轻轻晃动使液面保持水平状态，盖上杯盖，插入冰中。

4）启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV（此参数参考Bio-rad，具体使用请参考电转仪推荐参数来操作），将电击杯从冰中拿出，用吸水纸擦拭表面，吸干表面水渍，放入电转槽中，电击完成后，拿出电转杯放室温。

5）打开杯盖，15s内加入900 μl无抗生素的无菌S.O.C.培养基（已预热），用1ml枪吹吸电击杯底部2-3次，混匀后转移到50ml离心管，向离心管内补加S.O.C.培养基定容至10ml。于37℃，225rpm振荡复苏培养1h。

6）5,000rpm离心1min收菌，重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C.平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径150mm培养皿2~5个），用无菌玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。室温正置10 min，待液体被吸收后，倒置平板，37℃过夜培养13~17h。

【注意】：后续若想获得大量高纯度质粒，建议在TB培养基中于37℃摇菌培养，以对照质粒pUC19为为例，在TB培养基中过夜培养的菌体浓度和质粒产量，约是LB培养基的3-4倍，约是SOB培养基的2倍。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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